意大利文艺复兴最伟大的人物或许当推列奥纳多・达・芬奇（Leonardo da Vinci,1452~1519）。他称得上是阿尔贝蒂理想的文艺复兴全才（uomo universale）的化身，是那个时代最出色的集画家、建筑师、数学家、工程师和发明家于一身的巨人，举凡人的能力可以涉及的领域，达・芬奇似乎都愿意尝试研究。他虽然曾在米兰做过斯福札（Sforzas）家族的军事工程师，后来又到法国接受弗朗西斯一世的庇护，在法国生活、工作，最后死在那里，但他始终被认为是佛罗伦萨艺术家。达・芬奇留下的绘画作品并不算多，但几乎都堪称经典。
达・芬奇解剖习作
在达・芬奇的艺术创作中，科学研究具有重要的作用。他认为绘画本身就是一门科学，是从自然中产生的，是自然界一切可见事物的惟一的模仿者。在达・芬奇的研究笔记中，有大量的科学观察内容，其中包括大量研究人体解剖和比例的速写与分析草图。当然这与当时人们对科学研究的重视有关，科学与艺术的这种密切联系也表现在同时代许多艺术家身上，如雕刻家吉贝尔蒂（Lorenzo Ghiberti）对光学的研究、安东尼奥・波拉约洛（Antonio Pollaiuolo）等人对人体在运动中的肌肉组织的研究，以及音乐家对数学与声学的研究，都是此期文化情景中的重要特征。
《蒙娜丽莎》（The Mona Lisa（La Gioconda）），1503年―1507年，收藏于巴黎卢浮宫
《蒙娜丽莎》无疑是美术史上最著名的肖像画。这位头皮薄纱、穿着深色衣服，双手搭在椅子扶手上的女性，其谜一样的微笑吸引了几个世纪的人们，研究这幅作品的著作可谓汗牛充栋。对比一下画家作于20年前的《抱貂鼠的夫人》，《蒙娜丽莎》这件尺幅不大的作品（77 厘米×53 厘米）整个沉浸在深褐色的调子里，色调单纯了，细节却更为丰富，加上背景的山川、河流，意境更为深远。西方自彼特拉克以来，就有从自然界引申的隐喻来刻画人物心理状态的传统；研究者也乐于从画作的背景来找寻画中主人公的“真实”身份，以此来探究画家的意图。
《抱银貂的女子》（Lady with an Ermine），1485年-1490年，收藏于波兰克拉科札托里斯基博物馆
达・芬奇的高超技法令妩媚端庄的女性形象得到精神性的升华，此外，我们还应注意，“渐隐法”（sfumato,来源于意大利语fumo，意为“烟雾”，故又称“薄雾法”）的运用使得轮廓柔和地过渡，保持了生命的自然律动，而不至于像那些汲汲于雕凿的作品，因僵硬呆板而了无生气。
《最后的晚餐》（Last Supper），1498年，收藏于意大利米兰圣玛利亚感恩修道院
关注人物的内心世界及作品具有丰富的层次感，使达・芬奇能完美地揭示出其所画主题的深刻意义，令作品具有撼动人心的力量。《最后的晚餐》是画家应米兰大公斯福札的委托，画在圣玛丽亚慈悲修道院（S.Maria della grazie）的餐厅里的壁画，描绘了《圣经・马太福音》中记载的基督与门徒一起用晚餐，告诉他们自己要被他们中的一位出卖的故事。画家在这里要刻画出门徒们知晓此事时的惊讶、愤怒和恐惧等各种复杂的心态。而出卖基督的犹大是以下意识地手捂钱袋，并且流露出惊恐、不安的神情来表现。
达・芬奇认为绘画作品中最难的是通过人的身体、动作来反映出人的思想意向，他的探索在作品中取得了不容置疑的成功。在画法上,《最后的晚餐》采用了严格的焦点透视，并与实地的光源取得一致，构图庄重、均衡、和谐，创造了一种宏伟风格的绘画叙事语言，具有永恒的典范意义。